Su obra más importante es el Apologético en favor de Don Luis de Góngora, príncipe de los poetas líricos de España, contra Manuel de Faria y Sousa, caballero portugués, texto finalizado en 1600 y publicado en Lima en 1662. El Apologético, según la crítica, es el "primer tratado poético escrito en América por un español criollo",​ además de ser 'el primer gran ensayo de crítica literaria en esta América'. ​ Se trata de un texto fundacional de la crítica literaria (y para la teoría literaria) en el continente americano; además de ser, uno de los discursos más logrados que forman el cuerpo de comentarios a la poética y obra de Luis de Góngora (las palabras del crítico español Marcelino Menéndez Pelayo, sobre el Apologético, "una perla caída en el muladar de la poética culterana",​ demuestran su calidad dentro de la poética del gongorismo). El Apologético hace, pues, de Juan de Espinosa Medrano 'el primer crítico literario de América'. ​ Asimismo, permite ver en el autor a uno de los criollos más empeñados en la declaración de su condición de intelectual americano a receptores europeos. De esta forma, con el Apologético, Medrano exalta su condición de americano y da testimonio de la alta cultura y el intelecto de los hombres del Nuevo Continente​. Demuestra también la participación igualitaria de los hombres americanos (frente a los europeos) en la construcción de la cultura de occidente, pues el Apologético es una defensa de la cultura del Imperio Español y una exploración de la tradición poética occidental desde Grecia y Roma. ​ Por su contenido, el Apologético es una defensa de la poesía de Góngora y un análisis de las claves de su poética. En él, Espinosa Medrano refuta las críticas al estilo literario de Luis de Góngora y demuestra mediante la hermenéutica, la validez estética de su poesía y el ingenio de sus procedimientos literarios, especialmente el hipérbaton. ​ El texto, estructurado como debate, se divide en doce secciones, cada una de las cuales inicia con fragmentos de la obra de Faria y continúa con una contención del autor.​ Un pasaje famoso para ilustrar la obra corresponde a la exaltación de Luis de Góngora con que concluye el Apologético